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Plates-formes et plateaux techniques de notre institut

Publié le 26 janvier 2016



Notre institut a mis en place un ensemble de plates-formes et d’infrastructures d’hébergement dont l’objectif est d’offrir un service de très haut niveau aux équipes de l’Institut. Ce service est également ouvert aux autres structures grenobloises de recherche et, plus largement, à l’ensemble de la communauté scientifique, qu’elle soit académique ou industrielle. Afin de maintenir ces plate-formes à un haut niveau d’expertise, le choix a été fait en 2010 de les adosser à des équipes de recherche et de renforcer leurs compétences en soutenant les développements méthodologiques et technologiques. Alors que ces développements apportent un avantage concurrentiel aux équipes de recherche de l’institut, les plate-formes bénéficient, quant à elles, d’un environnement de recherche, environnement qui est un moteur d’innovation en étant source de nouveaux défis.


Plate-forme protéomique



La plate-forme EDyP-Service est la structure qui a été mise au service de la communauté scientifique dès l’année 2002 par l’équipe EDyP (BGE) afin de répondre de manière rapide, souple et professionnelle aux besoins de caractérisation des protéomes exprimés en dehors de projets de recherche soutenus par des agences de financement. Les analyses réalisées dans ce cadre correspondent à des demandes ponctuelles, ou constituent la première étape d’une interaction dont l’objectif est de produire des résultats préliminaires qui consolideront le dépôt d’un projet de recherche entre l’équipe EDyP et l’équipe collaboratrice dans le cadre d’un appel à projets. Pour remplir sa mission, EDyP-Service utilise les plates-formes instrumentales et les solutions informatiques de l’équipe de recherche EDyP. Alors que cette dernière assure les missions de recherche et développement en analyse protéomique, la plate-forme EDyP-Service transfère les méthodologies les mieux maîtrisées afin de les proposer en offre de service.
Les projets soumis à EDyP-Service sont sélectionnés en fonction de leur intérêt scientifique et de leur faisabilité. En amont de la soumission des projets, la plate-forme assure un rôle de conseil auprès des équipes de recherche qui le souhaitent. EDyP-Service prend ensuite en charge l’ensemble des tâches allant de l’analyse au rendu des résultats dans un format qui permet leur publication.

• L’équipe EDyP est un des trois partenaires de l’Infrastructure Nationale en Biologie et SantéProFI (Proteomics French Infrastructure ; Investissements d’Avenir) coordonnée par Jérôme Garin et qui, de ce fait, permet à EDyP de maintenir un parc instrumental de très grande qualité.
• L’équipe EDyP est membre de l’infrastructure européenne Prime-XS (Proteomics Research Infrastructure Maximising knowledge Exchange and access, FP7 Infrastructure project) coordonnée par Albert Heck (Professeur Université d’Utrecht, Pays-Bas). Dans ce cadre, la plate-forme EDyP-Service est une des 6 plates-formes de l’infrastructure qui offrent un accès à leurs expertises et services dans le cadre de projets sélectionnés par Prime-XS.
• L’équipe EDyP a obtenu la labellisation IBISA en 2010 dans le cadre du projet grenoblois GPI que Christophe Bruley (co-directeur EDyP) coordonnait.


Centre de criblage pour des Molécules Bio-Actives (CMBA)



La plate-
forme du CMBA a été spécialement conçue pour réaliser des cribles phénotypiques, c’est-à-dire des cribles qui utilisent des tests sur cellules vivantes basés sur la quantification de signaux d’absorbance, de fluorescence ou de luminescence (HTS), ou sur l'acquisition et l'analyse automatisées d'images en microscopie de fluorescence (HCS/HCA High Content Screening /High Content Analysis). Ce type de cribles offre un double intérêt : d’une part la sélection de composés actifs dans le contexte cellulaire, et d’autre part une meilleure caractérisation fonctionnelle de la fonction de protéines, sans a priori sur leur identité. En plus de son expertise dans le domaine des tests cellulaires, le CMBA possède le savoir-faire nécessaire à la mise en œuvre de tests biochimiques divers sur des protéines d’intérêt ou des cibles thérapeutiques purifiées. Ces stratégies in vitro mènent à la sélection de molécules ciblant une protéine d’intérêt, connue pour son rôle dans un processus biologique étudié ou une pathologie.

Le CMBA est très largement ouvert à la communauté scientifique. Ainsi, depuis 2009, 25 cribles ont été réalisés dont 14 pour des équipes de notre institut. Tous les domaines d’application en biologie, santé, bioénergie et environnement sont concernés, avec d’ores et déjà des molécules sélectionnées pour leur potentiel dans le traitement du cancer, des maladies infectieuses, ou dans la production de bio-carburant de 3ème génération.
Le CMBA accompagne les scientifiques dans l’évaluation de la faisabilité d’un projet de crible, les assiste dans les étapes de miniaturisation des tests « de paillasse » en microplaques, et procède ensuite à l’automatisation du test puis au crible pilote d’une banque de molécules chimiques de petite ou moyenne envergure. Le crible pilote apporte la preuve de concept de la pertinence du test biologique, de sa robustesse statistique et de sa maniabilité sur une plate-forme automatisée. Un crible de plus grande envergure est ensuite réalisé.

• Le CMBA, en partenariat avec le CCCHD (groupe de Chimie Combinatoire et de Criblage à Haut Débit, iBiTec CEA-Saclay), constitue la plate-forme G5C (Groupe de Chimie Combinatoire, Criblage Cellulaire et Chemogénomique) labellisée par le GIS-IBiSA depuis 2008. Le G5C met son expertise et son instrumentation au service de la communauté scientifique pour la découverte et la synthèse de molécules chimiques capables d’interférer sur le vivant.
• Le CMBA fait également partie du GDR3056 CNRS « ChemBioScreen » qui regroupe des plates-formes académiques françaises de criblage de molécules, des laboratoires de recherche développant des stratégies de chemogénomique, le réseau « EU-Openscreen » (European Infrastructure of Open Screening Platforms for Chemical Biology, “Chemical Keys for Life's Locks”).


Plate-forme μLiFe pour l’imagerie moléculaire et cellulaire



Les développements récents en imagerie visent à observer en temps réel la dynamique de l’ensemble des molécules impliquées dans un processus cellulaire donné. Afin de répondre à ces besoins, notre institut a mutualisé un ensemble d’équipements pour l’imagerie cellulaire et moléculaire autour d’une plate-forme qui a pour vocation de permettre à chaque utilisateur de bénéficier de la technique d’imagerie adaptée à la problématique scientifique posée. En plus de deux microscopes confocaux « classiques » préexistants, la plate-forme μLiFe a été équipée d’un nombre limité d’équipements de très haute technologie afin d’étudier le fonctionnement de la cellule au niveau moléculaire, avec un focus particulier sur l’étude de la localisation dynamique des protéines.

Les équipements sont accessibles à la communauté scientifique de notre institut, et plus largement à toutes les personnes intéressées par l’une des techniques proposées. Différents services sont proposés aux utilisateurs : une évaluation de l’adéquation du projet d’intérêt avec les techniques proposées sur la plate-forme ; un conseil sur la préparation des échantillons préalable à acquisition ; une formation théorique et pratique sur les équipements ainsi qu’un suivi personnalisé lors des premières utilisations, permettant ensuite le libre accès à un calendrier de réservation des équipements et une utilisation en autonomie ; la possibilité de stocker provisoirement ses données et de les transférer via un serveur dédié exclusivement aux utilisateurs de la plate-forme ; un libre accès à la station d’analyse ainsi qu’un conseil sur les techniques d’analyses appropriées.


Plate-forme Mössbauer



L’équipe de Physico-chimie des Métaux en Biologie (CBM/PMB) a mis en place en 2005 une plate-forme de spectroscopie Mössbauer. La spectroscopie Mössbauer est une spectroscopie magnétique qui permet d’analyser une quarantaine de noyaux, dont le fer, ce qui la rend particulièrement attrayante pour des applications en biologie. Elle est capable de détecter et de quantifier tout le fer contenu dans un échantillon, quel que soit son état chimique ou magnétique. En particulier, elle permet de caractériser les sites actifs de protéines à fer et d’étudier leur fonctionnement.
La plate-forme Mössbauer de notre institut est la seule en France à être dédiée à l’étude fonctionnelle des protéines à fer, et seules quatre installations comparables existent dans le monde (deux en Allemagne et deux aux Etats-Unis). Depuis 2009, la plate-forme s’est largement ouverte à des collaborations nationales et internationales, dont certaines ont acquis un caractère pérenne, renforçant ainsi la visibilité de notre institut dans le domaine des métaux en biologie. Les activités de la plate-forme couvrent trois domaines principaux : les protéines fer-soufre (biogenèse et activités enzymatiques), les espèces à haut degré d’oxydation du fer présentes dans les oxygénases et leurs modèles chimiques, et l’étude de systèmes polynucléaires complexes. Grâce à des expériences sous champ magnétique, une description fine de la structure électronique des ions fer peut être obtenue. En la couplant à la technique de mélange et congélation rapides « Rapid-mix freeze-quench », il est possible d’étudier les mécanismes d’action d’enzymes à fer. Par ailleurs, des études sur des cellules et des composants cellulaires permettent d’analyser des comportements globaux dans des conditions proches des situations in vivo. Ainsi, la spectroscopie Mössbauer est-elle utilisée pour étudier les perturbations de l’accumulation du fer en relation avec des pathologies.


Phytotrons et enceintes de culture végétale



Le laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale étudie les interactions entre les divers compartiments de la cellule végétale, leur modulation fine au cours des processus de différenciation cellulaire et leur perturbation par les conditions du milieu. Afin de réaliser ces études, des équipements phytotroniques sophistiqués sont nécessaires pour cultiver les plantes entières dans un environnement extrêmement bien contrôlé, que ce soit au niveau de la température, de l’intensité lumineuse, de l’hygrométrie et de la photopériode. Ces enceintes sont nécessaires notamment pour les études phénotypiques et génétiques de plantes sauvages, de mutants, ou de surexpresseurs. Des enceintes pour culture in vitro sont également utilisées pour cultiver des plantes entières dans des boites de Petri, notamment pour étudier la résistance des plantes aux métaux lourds et radionucléides ou la carence en nutriments (e.g. phosphate). L’impact des stress sur le fonctionnement et le métabolisme de la cellule végétale est également étudié sur des cultures cellulaires végétales d’Arabidopsis thaliana et d’érable. Des enceintes de culture sont nécessaires aux études réalisées sur les microalgues dans le cadre de travaux portant sur les biocarburants de troisième génération. Au final, le dispositif de cultures végétales de l’institut est constitué des équipements suivants :

• Deux salles de culture pour plantes entières de type S2 (12 m
2 et 18 m2 ; température réglable de + 16 à 30°C ; intensité lumineuse ~120 μmol de photons/m2/s ; hygrométrie de 35 à 75 %)
• Une salle de culture de plantes entières (4 m
2 ; température : ~23°C ; intensité lumineuse : ~150-180 μmol de photons/m2/s)
• Une enceinte de culture de plantes entières sous stress extrêmes (0,4 m
2 ; température variable de +6°C à +35°C ; intensité lumineuse pouvant aller jusqu’à 1500 μmol de photons/m2/s ; hygrométrie de 15 à 100 % : possibilité de brouillard par brumisateur).
• Une salle de culture cellulaire (13,6 m
2 ; température : 23°C ; intensité lumineuse : ~125 μmol de photons/m2/s)
• Une enceinte de cultures in vitro (2,6 m
2 ; température réglable de +16 à 30°C ; ~80 μmol de photons/m2/s)
• 12 armoires de cultures, dont 10 sont utilisées pour la culture de plantes entières et 2 pour la culture des microalgues.
• Six armoires pour la culture de plantes entières installées dans une salle aux normes des serres de type S2.


La moucherie



La pièce d’élevage de drosophiles comprend 4 postes d’observation des drosophiles (loupes binoculaires), un poste de prise de vue (loupe à fort grossissement équipée d’un module à fluorescence et d’une caméra), et un microscope à contraste de phase qui peut servir à l’observation d’embryons. Ce poste est équipé d’un micromanipulateur pour l’injection d’embryons en vue de la création de lignées transgéniques. Chaque poste est alimenté par une arrivée en gaz carbonique et d’un système permettant sa diffusion sur un plateau où sont placées les mouches endormies (observation, tri). La pièce comprend également 2 étuves d’élevage (réglée à 25°C ou 17°C) et une petite étuve à température variable (en général utilisée à 28-30°C), un réfrigérateur et divers petits équipements.
À l’institut, l’utilisation de la drosophile répond à des critères d’analyse à grande échelle sur le vivant ainsi qu'à des critères éthiques d’utilisation de modèles non-mammifères dans la mise en œuvre de stratégies pionnières pour comprendre et soigner le vivant. L’infrastructure pour l’élevage et l’étude des drosophiles est gérée et financée par l’équipe Gen&Chem (BGE/iRTSV) qui utilise ce modèle pour découvrir de nouveaux mécanismes de régulation de la réponse immunitaire et inflammatoire. Cette équipe est régulièrement sollicitée pour fournir du matériel biologique (larves et mouches adultes) à des laboratoires grenoblois (faculté de médecine, EMBL).


Analyse et tri cellulaire



Depuis l’année 2000, l’institut est équipé d’une plate-forme d’analyse et tri cellulaires. Deux instruments équipent cette plate-forme :
(i) un analyseur BECTON FACScalibur (2 lasers 488nm & 633nm) qui permet l’analyse des cycles cellulaires et proliférations, le suivi d'événement apoptotiques, de la viabilité cellulaire, de l’activité mitochondriale ;
(ii) un trieur de cellules, Beckman Coulter MoFlo (3 lasers 488nm, 633nm & UV) couplé à un robot. Ce dispositif permet de séparer jusqu’à quatre populations cellulaires, à haute vitesse, et avec sortie sur plaque (6 à 96 puits ; 1 à x cellules par puits. Il est utilisé pour le tri de cellules transfectées, de cellules souches, de cellules spécifiquement marquées en vue d’analyses ADN, ARN ou de remise en culture.


Mesure de la diffusion de la lumière
Depuis 2010, notre institut possède une plate-forme de mesure de diffraction de la lumière. Cette plate-forme est constituée d’une HPLC (équipée d’un détecteur d’absorbance à barrette de diode), dédiée à la chromatographie d’exclusion de taille, qui peut être couplée à trois détecteurs en ligne : un réfractomètre (mesure absolue de la concentration), MALLS (Diffusion de la lumière à 18 angles) et DLS (Diffusion dynamique de la lumière). L’utilisation conjointe de ces instruments permet d’avoir accès à la masse moléculaire, la taille, l’élongation et l’homogénéité d’objets biologiques (protéines) ou inorganiques (polymères) en solution avec une bonne précision (de l’ordre du kDa pour les protéines). Cette plate-forme permet notamment l’étude des interactions entre protéines, de la forme des nanoparticules dans un environnement biologique, de la propension à cristalliser des protéines.

Plateau de spectrophotométrie
Depuis 2012, l'institut possède une plate-forme de spectrophotométrie rassemblant un fluorimètre et un spectropolarimètre équipés de différents accessoires, dont des blocs thermostatés multi-cuves à effet Peltier. Les mesures de fluorescence allient sensibilité et spécificité pour la détection, la quantification et l'étude de diverses molécules (protéines, drogues ou molécules organiques, enzymes grâce à des substrats fluorescents...) dans divers milieux (extraits, cellules en suspension, tampons...). Notamment, les mesures de FRET et d'anisotropie de fluorescence permettent d'analyser les interactions protéine/protéine ou protéine/substrat. La fluorescence intrinsèque des protéines fournit des informations sur le repliement et les changements de conformation. Les mesures de dichroïsme circulaire sont le plus communément utilisées pour sonder les structures secondaire et tertiaire des protéines et l’effet de différents traitements et de la température, ceci afin de déterminer la stabilité des protéines ainsi que leur état conformationnel.