Vous êtes ici : Accueil > Labo CBM > Groupe Modélisation et Chimie Théorique

Groupe Modélisation et Chimie Théorique

Publié le 14 mars 2017



Responsables
  Serge Crouzy

Tel. : 04 38 78 29 63
  Yohann Moreau

Tel. : 04 38 78 29 62
 
Adresse
Institut de Biosciences et Biotechnologies de Grenoble
CEA-Grenoble
LCBM
17 avenue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
Membres du groupe​​
Serge Crouzy, chercheur CEA
Yohann Moreau, Maître de Conférences Université Grenoble Alpes
Serge Nader, doctorant
Rolf David, doctorant
Giulia Veronesi, Chercheur CNRS

Plan
1Présentation générale du groupe
1.1 Vocation scientifique
1.2 Personnel

2 Activité scientifique
2.1 Chimie Théorique : Réactivité des métalloprotéines
2.1.1 Étude de la réactivité de « spore Photoproduct Lyase »
2.1.2 Aide à la fonctionnalisation de protéines
2.1.3 Rôle des résidus voisins du site actif dans l'oxydation catalytique de hydroxyphényl pyruvate par HPPD
2.2 Modélisation, Prédiction de structure et Dynamique Moléculaire des métalloprotéines
2.2.1 Introduction
2.2.2 Interactions Métaux-Ligands et développement de potentiels
2.2.3 Étude du transfert du métal entre chaperonnes et ATPases
2.2.4 Dynamique d'un complexe peptide-Gd3+ pour l'IRM
2.3 Amarrage moléculaire « Docking »
2.3.1 Amarrage moléculaire de peptides sur le régulateur de transcription FUR - screening virtuel
2.4 Modélisation des protéines membranaires et insertion de protéines dans les membranes
2.4.1 Modélisation des ATPases à métaux lourds
2.4.2 Modélisation des canaux ioniques
2.4.2.1 Amarrage moléculaire du TEA sur un canal ionique
2.4.2.2 Mécanisme de transfert du signal conduisant à l'ouverture d'un canal ionique

3 Développement de logiciels
3.1 Simulateur de DM Adaptatif
3.2 Modélisation « gros grain »
3.3 Logiciel de visualisation de protéines, MPV3D
3.4 Utilitaires en libre accès

4 Méthodes
4.1 Prédiction de structures
4.2 Mécanique et Dynamique Moléculaire (MM/DM)
4.3 Calculs d'énergie libre : exemple de l'insertion du chlorure de tosyl dans la cyclodextrine
4.4 Chimie quantique, Mécanique Quantique (QM)
4.5 Méthodes mixtes Mécanique Moléculaire / Mécanique Quantique (QM/MM) : Application à la réactivité des métalloprotéines

1 Présentation générale du groupe
1.1 Vocation scientifique
Nous avons pour première vocation une activité de support aux expérimentateurs (biologistes et chimistes) du laboratoire de chimie et biologie des métaux pour l'exploitation de leurs données grâce à des modèles théoriques. Nous menons également des projets collaboratifs avec diverses équipes de biologistes, chimistes et informaticiens sur le site de Grenoble
Les méthodes que nous utilisons balaient un large spectre depuis la bioinformatique (screening in silico) jusqu'aux techniques les plus avancées de QM/MM (réactivité des sites métalliques des métalloprotéines dans leur environnement protéique) en passant par la prédiction de structure de protéines et la mécanique (MM) et la dynamique moléculaires (DM) classiques. Nous développons également divers programmes, tels qu'un programme de visualisation moléculaire et participons à un projet de simulateur adaptatif.
1.2 Personnel
Serge Crouzy, Chercheur CEA, tel 04 38 78 29 63
Yohann Moreau, MCF UJF Grenoble tel 04 38 78 29 62
Cheickna Cissé, Étudiant en thèse (codirection avec l'équipe BioMet), tel 04 38 78 48 48
• Étudiants stagiaires en 2011 :
Justine Lévêque (L3), Magda Benisz et Antoine Fouquet (M1), Silouane Gérin (DUT) tel 04 38 78 48 48
• Anciens collaborateurs cités dans ces pages :
Michel Ferrand (chercheur CEA), JF Fuchs et H Nedev (PostDocs), David Poger et Karthik Arumugam (Thèses), J Flocard, M Ortega, Mathieu Isorce, Mael Bosson, Hugo Deboise (stagiaires)

2 Activité scientifique
2.1 Chimie Théorique : Réactivité des métalloprotéines
2.1.1 Étude de la réactivité de « spore Photoproduct Lyase »
Yohann Moreau, (Collaboration équipe LCBM/BioCat et Inac)
La résistance au rayonnement UV de l'ADN des spores dormantes de bactéries telles que Bacillus repose sur l'activité de l'enzyme à Fer-Soufre ''spore photoproduct lyase'' (SPL). Le rôle de cette dernière est de catalyser la réparation d'une lésion de l'ADN formée d'une liaison entre deux thymines adjacentes (Figure suivante). Des études expérimentales et théoriques ont montré que le mécanisme faisait intervenir le radical 5'-deoxy-adenosyl.



Processus d'endommagement par rayonnement et de réparation par la SPL d'un dimère de thymines dans l'ADN.

Un travail préliminaire sur un modèle quantique simple a montré l'influence de la conformation du substrat sur la réactivité et ainsi mis en évidence l'importance de la prise en compte de l'environnement dans l'étude du mécanisme réactionnel. Afin de modéliser le mécanisme de réparation en travaillant sur un système réaliste, nous devons alors prendre en compte la structure du site actif, ainsi que le brin d'ADN endommagé en interaction avec l'enzyme. L'utilisation de la méthodologie QM/MM nous permet alors d'être en mesure de proposer un mécanisme rendant compte de la réalité biologique.
2.1.2 Aide à la fonctionnalisation de protéines
Yohann Moreau, (Collaboration Vincent Forge, Nicolas Durrafourg, équipe LCBM/AFFOND)
Stagiaire L3 : Justine Lévêque
Stagiaire M1 : Magda Benisz
L'essor actuel des nanotechnologies conduit à imaginer la possibilité de modifier les structures naturelles que sont les protéines pour en faire des éléments aux propriétés contrôlées. Ainsi, il est tout à fait envisageable, grâce à la mutagenèse dirigée, d'en modifier un domaine pour un faire un site actif dont le rôle sera finement défini. Cependant, le nombre important de modifications possibles sur une seule protéine nous conduit à envisager, au préalable, une série d'études théoriques afin de déterminer quelles seront les plus à même de donner les propriétés voulues.

Alignement du site artificiel obtenu par mutation de 4 acides aminés de la protéine Het-S avec le site natif de la plastocyanine (transparent). Géométries optimisées en DFT.
A l'aide des méthodes de la chimie quantique, de la QM/MM et de la dynamique moléculaire classique, nous nous attachons donc à étudier les différentes mutations possibles d'une série d'acides aminés d'un domaine donné de la protéine d'intérêt. Cela nous permet d'en étudier les effet sur la structure locale (géométrie, stabilité, etc…) mais aussi globale et ainsi proposer aux expérimentateurs du projet les mutations qui donneront les propriétés recherchées à la structure modifiée. Cette thématique, initiée depuis peu a déjà fait l'objet d'un stage de L3. Durant celui-ci, il a pu être mis en évidence la possibilité de reproduire les caractéristique géométriques et électroniques d'un site actif de plastocyanine dans la matrice d'une protéine cible dont quatre acides aminés ont été modifiés (
Figure ci-contre) dans ce but.
2.1.3 Rôle des résidus voisins du site actif dans l'oxydation catalytique de hydroxyphényl pyruvate par HPPD
Yohann Moreau, Serge Crouzy (Collaboration avec l'équipe de Michel Matringe du Laboratoire de Physiologie Cellulaire & Végétale de notre institut)
Structure intermédiaire dans l'étape clé d'hydroxylation du cycle du substrat (en boules/bâtons). Résultats obtenus par l'approche QM/MM. Les atomes non transparents appartiennent au sous-système quantique.
4-HPPD (4-hydroxyphényl pyruvate dioxygenase) est une enzyme dont le rôle est de catalyser la transformation de 4-hydroxyphényl pyruvate (HPP) en homogentisate (HGA). L'activité catalytique de cette enzyme repose sur un site actif comportant un atome de fer (Figure ci-contre).
Nous nous sommes attaché à étudier le rôle des certains résidus adjacents au site actif dans le chemin réactionnel. En effet des expérience de mutagenèse dirigée de ces résidus ont montré leur rôle crucial.
A l'aide de l'approche QM/MM utilisant un modèle de coupure de type link-atom et la polarisation directe de la région QM par le 'environnement MM, nous avons donc étudié les structures correspondant aux étapes clés de l'oxydation de HPPD en HGA.
Nos calculs ont en particulier mis en évidence une forte interaction du groupement hydroxyde du substrat avec deux résidus (S260 et N275) sous forme de deux liaisons hydrogène ((
Figure ci-contre) au cours du processus réactionnel. Cette interaction a pour conséquence de contraindre l'orientation du substrat par rapport au site actif et ainsi de favoriser le chemin réactionnel conduisant à la formation de HGA. Ces données viennent ainsi étayer les résultats de mutagénèse dirigée qui on montré une différence notable d'activité quand les résidus concernés sont remplacés par d'autres moins polaires.
Ces résultats sont publiés dans Journal of Biological Chemistry[13].
2.2 Modélisation, Prédiction de structure et Dynamique Moléculaire des métalloprotéines
2.2.1 Introduction
La modélisation c'est-à-dire le recours à un modèle simplifié pour expliquer un phénomène a trois applications principales en biologie et chimie :

Raffinement de structures.
En RMN par la donnée de distances inter-atomiques (2 à 5 Å) et d'angles dièdres.
En cristallographie aux rayons X par la donnée de diagrammes de diffraction.
Prédiction de structure.
Prédiction de la structure secondaire ou tertiaire des protéines à partir de leur séquence : Modèles par homologie.
Extraction d'images temporelles de l'évolution d'un système simulé en MM classique servant de base à une étude de type QM/MM.

Simulation : une expérimentation numérique in silico complémentaire aux expériences classiques in vitro ou in vivo permettant :
de calculer des observables expérimentales et de tenter de déduire les mécanismes qui les déterminent.
d'obtenir de grandeurs au-delà des possibilités expérimentales dans des conditions parfaitement contrôlées de pureté, pression, température.
de tester notre compréhension d'un phénomène à l'échelle atomique.
de visualiser les conséquences de l'agitation thermique sur les structures macromoléculaires (accès de substrats à des sites enzymatiques, transitions conformationnelles, influence de l'eau, couplages entre mouvements.)

Notre activité recouvre les trois thématiques précédentes mais l'aspect simulations de macromolécules afin de comprendre certains aspects de leur fonction à partir de leur structure est prépondérant.

Dans une approche MM classique, toute molécule étant l'association de divers atomes, la cohésion de cet ensemble résulte des interactions répulsives et attractives entre les atomes et va être modélisée par un système purement mécanique de forces, sans prendre en compte la nature microscopique et électrostatique (quantique) des interactions entre les électrons et les noyaux.
Une macromolécule est ainsi modélisée par un réseau de masses ponctuelles chargées en leur centre, reliées par des ressorts et interagissant via des potentiels empiriques.

Suivre ce lien pour une brève introduction à la mécanique (MM) et à la dynamique moléculaires (DM).
Nous présentons dans la suite quelques illustrations de nos travaux en cours selon trois axes principaux :

Dans une approche de chimie théorique par mécanique quantique QM, le système, souvent un site actif de protéine, est modélisé au niveau électronique avec une approche dite ab initio (non paramétrée). Dans l'approximation de Born Oppenheimer, les noyaux atomiques sont considérés comme fixes dans l'étude des mouvements des électrons.

Enfin, dans une approche de type QM/MM, une grande partie de la macromolécule est traitée en MM et même, en partie gelée, tandis que le site d'intérêt est traité en QM.
2.2.2 Développement de potentiels modèles pour le cuivre(i) et le mercure(ii)
(JF Fuchs, H Nedev, Michel Ferrand) et Serge Crouzy (Collaboration avec JP Dognon et N Brenner, CEA Saclay)
Nous avons développé de nouveaux champs de force de mécanique moléculaire basés sur CHARMM, pour étudier les interactions entre métaux lourds Cu(I) et Hg(II) et les métallo-chaperonnes de la famille d'Atx1. Les paramètres du champ de force sont optimisés à partir de calculs de chimie quantique (ab initio) sur de petits fragments mimétiques de la boucle de chélation des métaux dans Atx1. Nous nous sommes focalisés sur les paramètres impliquant l'ion métallique et les atomes de soufre des 2 cystéines du site de chélation ; l'exemple de l'ajustement du potentiel ab initio correspondant à la rotation de l'angle dièdre ?CSSC par une fonction cos dans le champ de force de CHARMM est détaillé sur la figure suivante.



Vue du fragment Cu(I)-diméthyl-thiolate mimétique du site de liaison des métaux de la protéine Atx1. De l'étude par chimie quantique de la variation de l'énergie du fragment lorsque l'on fait tourner le plan C1S1S2 par rapport au plan S1S2C2 d'un angle ?, on déduit les paramètres k? et ? du champ de force conduisant au meilleur ajustement entre énergie ab initio et énergie MM.

A partir de ces paramètres, nous effectuons de longues simulations de DM des métallochaperones sous forme apo ou en présence de Cu(I) ou Hg(II). Les protéines sont insérées dans des boites d'eau et simulées en conditions périodiques.
2.2.3 Étude de transfert du métal entre chaperonnes et ATPases
Serge Crouzy, (David Poger, Karthik Arumugam)
Nous menons un projet portant sur la spécificité et l'affinité de l'interaction de différents ions métalliques (Cu+, Hg2+, Cd2+, Pb2+) pour les métallo-chaperonnes à Cu(I) (Atx1 dans la levure et Hah1 chez l'homme) et pour leurs ATPases associées (Ccc2 et Menkès, respectivement). L'étude de la dynamique de la métallochaperone Hah1 et de la sélectivité de la liaison du Cu+ et du Hg2+ sur cette protéine a été réalisée par David Poger pendant sa thèse au laboratoire [1, 7]. Une caractéristique intéressante des ATPases de type P1 (voir 2.4.1) est la présence en N-ter de un à six domaine(s) de liaison des métaux (MBDS). Dans le cas de l'ATPase de Menkès, il y a 6 MBDs, chacun pouvant lier un ion Cu+. La structure de chaque MBD est connue. En utilisant des simulations de DM, nous avons étudié la dynamique de chaque MBD en présence ou absence de métal dans le but de comprendre comment le métal est transféré de la métallochaperone qui prend en charge le métal lors de son entrée dans la cellule au MBD. Ces études ont utilisé notre travail dans le domaine de la paramétrisation des ions métalliques pour des champs de force de mécanique moléculaire (voir 2.2.2). Les figures suivantes (Figures A et B suivantes) montrent les interactions possibles entre la métallochaperone soluble Hah1 et le premier domaine de liaison des métaux (Mnk1) de son partenaire membranaire : l'ATPase de Menkès.

A - Cartes de potentiel électrostatique et structure secondaire, dans la même orientation, pout Hah1 et le domaine de liaison 1 de l'ATPase de Menkès (Mnk1). Les 2 protéines ont été tournées de 90 degrés afin de présenter à la vue leurs faces en interaction. Hah1 contient un cuivre (sphère jaune) qu'elle est censée transférer à Mnk1 dans son état Apo.



B - Représentations de la métallochaperone Hah1 et du premier domaine de l'ATPase de Menkès (Mnk1) tels qu'ils devraient interagir (après rapprochement) dans l'hypothèse d'une interaction à dominante électrostatique. Les dipôles électriques alignés des deux protéines sont représentés.


Le bon accord de nos résultats de DM sur les MBDs avec les connaissances expérimentales a montré que des modèles mécaniques sont capables de rendre compte et d'expliquer certaines propriétés de liaison et de transport des métaux dans les métalloprotéines et les ATpases, cibles pharmaceutiques bien connues.
2.2.4 Dynamique d'un complexe peptide-Gd3+ pour l'IRM
Serge Crouzy (Collaboration avec P Fries et P Delangle du CEA/Inac/SCIB)
L'ion Gd3+ présente une très forte valeur de spin électronique (S = 7/2) à cause de 7 électrons 4f non appariés et donc un moment paramagnétique exceptionnellement élevé. Lorsque des complexes Gd3+-Ligand en solution sont placés dans un champ magnétique, les temps de relaxation des spins nucléaires du solvant, mesurés par RMN (1/T1, 1/T2) sont fortement augmentés. En IRM (Imagerie par Résonnance Magnétique) la relaxivité des protons de l'eau est importante puisqu'elle est une mesure de l'efficacité du complexe GdL à améliorer le contraste des images. Un des buts de l'équipe de P Fries et P Delangle est donc de mettre au point des agents de contraste conférant une forte relaxivité à l'eau qui les entoure. P Fries mène des études théoriques dans lesquelles il distingue 3 types de dynamique intermoléculaire des molécules d'eau : sphère externe (« bulk »), sphère interne dans laquelle on trouve les molécules d'eau liées à l'ion Gd3+ et enfin seconde sphère dans laquelle les molécules d'eau interagissent avec le ligand L. Nous avons réalisé des simulations de DM de l'ion Gd3+ coordonné au ligand peptidique (L) = DREPGEWDPG dans l'eau afin de déduire des paramètres de diffusion et relaxation des molécules d'eau nécessaires pour ajuster les modèles théoriques (cliquer sur l'animation ci-dessous pour sa lecture). Nous avons ainsi montré une forte contribution des molécules d'eau de seconde sphère à la relaxivité mesurée.



Animation montrant le mouvement des molécules d'eau autour de l'ion Gd3+ coordonné par le peptide (L). sur une durée de 100 ps. Les molécules d'eau de seconde sphère (oxygène en vert) présentent de grandes amplitudes de déplacements indiquées en Å malgré les conditions périodiques artificielles introduites par la boite de simulation. Les temps de résidence de ces molécules d'eau autour du peptide dépassent la durée de l'animation (100 ps) tandis que les molécules d'eau de première sphère (oxygène en orange) restent liées à l'ion mais oscillent autour de celui-ci.
2.3 Amarrage moléculaire « Docking »
2.3.1 Modélisation de l'inhibition du régulateur de transcription FUR par des aptamères peptidiques
Travail de thèse de Cheickna Cissé (Collaboration avec Isabelle Michaud Soret de l'équipe BioMet)
La protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) est une cible antibactérienne potentielle. Elle régule des fonctions essentielles chez les bactéries et est spécifique des microorganismes. Au laboratoire des inhibiteurs interagissant spécifiquement avec FUR ont été isolés par la technologie des aptamères peptidiques. Le but du travail de l'équipe d'Isabelle Michaud-Soret est de comprendre le mécanisme d'inhibition de la protéine et d'en déduire d'autres molécules inhibitrices pour des applications thérapeutiques. Des études de modélisation et d'interaction biochimiques sont menées pour aboutir à cette fin.
L'étude de l'interaction de la protéine FUR et des inhibiteurs par amarrage moléculaire (« Docking ») avec AUTODOCK4.2 a permis de proposer des interactions entre les atomes des inhibiteurs et les acides aminés de la protéine. Les modèles par homologie de la protéine FUR ont été construits avec MODELLER en présence d'ions métalliques Fe2+. Les interactions trouvées par Docking ont été examinées par le test de liaison à l'ADN de FUR.
Un modèle de l'interaction de FUR+3Fe avec un inhibiteur (noté I1) a été proposé ; ce dernier présente une excellente affinité théorique pour la forme activée de Fur. Dans cette configuration, l'inhibiteur interagit dans une poche protéique où il inhibe la liaison de la protéine à l'ADN et agit sur les deux domaines de la protéine
(Figure suivante). Ce résultat s'accorde avec les travaux antérieurs de double hybride faits avec les aptamères peptidiques indiquant que cet inhibiteur nécessite les deux domaines de la protéine pour interagir.
-Dans le cadre d'une collaboration avec un laboratoire Norvégien, via le programme AURORA, un screening a été réalisé avec 2 programmes d'amarrage moléculaire commerciaux : GLIDE et GOLD permettant d'identifier des petits ligands qui s'amarrent dans la même poche que l'inhibiteur I1, avec une bonne affinité. Ces petites molécules feront l'objet de tests expérimentaux prochainement.



À gauche : Modèle de FUR d'E. coli par homologie avec FUR de Vibrio cholerae et en présence de 3 atomes métalliques par monomère (sphères vertes) et à droite représentation 3D de l'inhibiteur I1 amarré sur le modèle de la protéine FUR avec Autodock. (Représentations avec VMD).

Une surproduction de FUR d'E. coli suivie d'une purification sont faites au laboratoire avec pour but de faire des essais de co-cristallisation protéine FUR/peptide pF1. Les premiers essais faits par Sandra Galop et envoyés à l'IBS montrent des résultats encourageants. D'autres conditions d'essais et d'optimisation ont été réalisées à Tromso dans le cadre d'une collaboration (projet AURORA). Les premiers résultats montrent la formation de miniscules cristaux dans certaines conditions.
2.4 Modélisation des protéines membranaires et insertion de protéines dans les membranes
Au sein du laboratoire Chimie et Biologie des Métaux, certains chercheurs ont gardé une expertise et un grand intérêt pour les protéines membranaires, transporteurs ABC, canaux ioniques et ATPases. Nous présentons ci-après quelques travaux passés qui gardent un intérêt, au moins méthodologique, ainsi que des travaux en cours grâce à des financements de l'Agence Nationale pour la Recherche.
Citons en premier lieu nos travaux théoriques sur les ATPases, spécialité des biologistes de l'équipe BioMet avec lesquels nous collaborons.
2.4.1 Modélisation des ATPases à métaux lourds
(Karthik Arumugam), Serge Crouzy (Collaboration avec Patrice Catty LCBM/BioMet, thèse de Karthik Arumugam coencadrée par Stéphane Redon, Inria)
La connaissance de la structure des ATPases de type P est d'un grand intérêt dans nos études qui visent à comprendre le transport des métaux. Les ATPases de type P sont des protéines membranaires qui assurent le transport actif d'ions contre leur gradient électrochimique en utilisant l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP. Il y a une dizaine d'années ont été découvertes des ATPases spécialisées dans le transport de métaux lourds, divalents Pb2+, Hg2+, Co2+, Zn2+ ou Cd2+, ou monovalents Ag+ et Cu+. Elles forment une sous-famille, dénommée P1, encore assez mal connue. Parmi les ATPases de type P connues depuis plusieurs décennies seule l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique a été cristallisée à ce jour et sa structure a été résolue dans diverses conformations. C'est donc tout naturellement cette protéine, dont le cycle enzymatique est bien connu, qui sert de modèle biochimique et structural pour l'étude de toutes les autres ATPases de la famille. Depuis quelques années, les biochimistes et enzymologistes du laboratoire se sont attachés à mieux comprendre le mécanisme de transport des métaux lourds au travers d'une membrane, en étudiant la protéine CadA, l'ATPase-Cd2+ de Listeria monocytogenes, homologue de l'ATPase à cuivre Ccc2 rencontrée dans la levure. L'absence de données structurales concernant CadA ou Ccc2, impose de raisonner par homologie avec l'ATPase calcium, pour interpréter les résultats expérimentaux portant sur le transport actif du cadmium ou du cuivre.
Modèle du site actif de l'ATPase CadA montrant 2 ions Cd2+ (sphères oranges) coordonnés aux acides aminés des hélices III, VI, VII et VIII de la protéine. On voit, entre autres, les cystéines C354 et C356 du motif CPC.
Durant la thèse de Karthik Arumugam, nous nous sommes intéressés à la structure et à la dynamique de la partie membranaire de l'ATPase cadmium CadA et aux domaines de liaison du métal de l'ATPase cuivre humaine de Menkès. Similarité de séquence et analyses d'hydropathie, complétées par des expériences ont montré que les ATPases de type P1 sont constituées de 8 segments transmembranaires (TMs) au lieu de 10 pour l'ATPase calcium de structure connue. En collaboration avec les biochimistes, et en utilisant les programmes MODELLER, CHARMM, XPLOR, SAMSON ainsi que nos propres programmes, nous avons prédit la structure des TMs de CadA. Nous avons construit plusieurs modèles du paquet de TMs correspondant à plusieurs topologies, calculé les coordonnées atomiques avec une procédure similaire à la détermination de structure à partir d'expériences de RMN et raffiné ces coordonnées en utilisant des simulations de DM en présence de solvant implicite (
Figure ci-contre). Le programme SAMSON (voir 3.1) a été utilisé pour vérifier les modèles de manière interactive.
2.4.2 Modélisation des canaux ioniques
Nous nous intéressons également depuis longtemps à la structure et à la fonction des canaux ioniques [3] qui permettent le passage sélectif d'environ 109 ions dans le sens de leur gradient électrochimique ainsi qu'aux transporteurs ABC [2, 8] présents chez les bactéries et les eucaryotes. Et qui permettent soit l'import, soit l'export d'une grande variété de substrats, drogues.
2.4.2.1 Amarrage moléculaire du TEA sur un canal ionique
Serge Crouzy (Collaboration avec Benoît Roux - Université de Chicago)
Dans le cadre d'une étude théorique du transport ionique dans les canaux, nous avons étudié le blocage du canal potassique KcsA par le Tetra Ethyl Ammonium (TEA) par simulations de DM sur le canal muté ainsi que plusieurs de ses mutants dans un environnement membranaire explicite. Nous avons montré, en très bon accord avec l'expérience, par des calculs de profils d'énergie libre de la liaison du TEA sur le canal que ce dernier se liait préférentiellement sur les canaux présentant un résidu aromatique en position 82.



Vues (selon le plan de la membrane, à gauche, et le long de la normale à la membrane, à droite) du canal potassique KcsA bloqué par le TEA. Les molécules d'eau et les ions potassiques (sphères jaunes) à l'intérieur de la cavité et dans le filtre de sélectivité sont représentés en CPK ainsi que le TEA. Les lipides sont omis pour plus de lisibilité.
2.4.2.2 Mécanisme de transfert du signal conduisant à l'ouverture d'un canal ionique
(Karthik Arumugam), Serge Crouzy (collaboration avec Michel Vivaudou et C Moreau, IBS Grenoble) - Post-doc recherché (ABG-30009)
Nous travaillons avec l'équipe de Michel Vivaudou sur le projet ANR ICCR (Ionic Channel Coupled Receptors). Un ICCR est un récepteur membranaire (GPCR : récepteur aux protéines G) couplé à un canal ionique pour former un canal artificiel dont l'ouverture est régulée par le ligand du récepteur. Un premier ICCR a été construit dans l'équipe de Michel Vivaudou, par l'ingénierie des protéines de fusion entre le canal potassique Kir6.2 et un GPCR prototype le récepteur muscarinique humain : HM2. Les changements de conformation qui résultent de la fixation du ligand acétylcholine (ACh) sur HM2 sont transmis à Kir6.2 et les courants ioniques résultant (pA) sont détectés avec des techniques électrophysiologiques.
Nous recherchons, par modélisation, une approche rationnelle pour la construction de nouvelles protéines de fusion fonctionnelles.
Le travail en cours consiste à prédire les structures des partenaires (lorsqu'elles sont inconnues), positionner in silico le GPCR par rapport eu canal, construire le tétramère fonctionnel puis rechercher le mécanisme de transduction du signal entre GPCR et canal conduisant à l'ouverture (ou à la fermeture) de ce dernier.
La
figure suivante montre un premier modèle de structure de HM2 couplé à Kir6.2.

A
B


Modèle de structure du récepteur aux protéines G muscarinique humain HM2 couplé au canal potassique Kir6.2. Chaque monomère du tétramère est représenté d'une couleur différente.
A : vue de dessous, côté cytoplasmique.
B : vue de face.

3 Développement de logiciels
3.1 Champ de force pour un Simulateur de DM Adaptatif et applications
Serge Crouzy, A Fouquet (J Flocard, Mathieu Isorce, Mael Bosson, Hugo Deboise) (Collaboration avec Stéphane Redon - Équipe Nano-D de l'Inria)
Principe du fonctionnement de l'algorithme de Featherstone : la protéine est représentée sous forme d'un enchaînement d'objets rigides articulés autour des angles dièdres. Chaque objet ainsi défini est modélisé par une feuille d'un arbre binaire. Lorsqu'une force est appliquée, l'algorithme détermine la région de l'arbre correspondant aux accélérations les plus importantes (en vert) et considère le reste de la structure comme rigide.
Nous avons obtenu en 2006 un financement de l'Agence Nationale pour la Recherche sur un projet de simulateur de DM. écrit par nos collaborateurs à l'Inria. Le but était de développer un outil de visualisation interactive et de nouveaux algorithmes pour l'étude dynamique et la manipulation interactive de macromolécules biologiques à partir du travail de Stéphane Redon sur les objets articulés. En raison de la complexité importante des structures et interactions qu'ils étudient, les biologistes utilisent fréquemment des représentations simplifiées et incorrectes de la géométrie et de la dynamique des molécules impliquées. Pour pallier ce problème, l'équipe Nano-D de l'Inria développe le programme SAMSON (System for Adaptive Modeling and Simulation Of Nano-objects), capable de déterminer automatiquement le niveau de détail le mieux à même de représenter une interaction moléculaire donnée. Ce simulateur de dynamique moléculaire est adaptatif, interactif et multi échelle [6]. Nous avons, en 2009, obtenu un nouveau financement visant à poursuivre le développement de SAMSON. Les applications visées concernent notamment l'étude de systèmes macromoléculaires complexes en biologie, chimie et nanotechnologies.
SAMSON permet de simuler des protéines représentées sous formes d'objets rigides articulés (
Figure de droite). Le calcul des énergies et des forces est adaptatif au sens où l'ordinateur détermine automatiquement, selon le niveau de précision choisi par l'utilisateur, quelles sont les articulations dont les accélérations sont calculées à chaque pas de temps.
Notre rôle est d'aider à l'implémentation dans SAMSON de divers champ de force utilisés en biologie et en chimie. Dans la version actuelle nous prenons en compte deux représentations classiques adaptées à la dynamique dans l'espace des angles dièdres : un modèle tout atome (Type CHARMM22) et un modèle atome étendu (Type CHARMM19) (stage de Mathieu Isorce) et un modèle de molécules carbonées autorisant des ruptures de liaison (BRENNER) : (stage de Mael Bosson). Nous avons récemment travaillé à l'ébauche d'un modèle dans l'espace des coordonnées cartésiennes et d'un modèle de simulation « gros grain » (modèle de Martini) dans lequel plusieurs atomes sont regroupés à l'intérieur d'une même entité moléculaire traitée comme un corps rigide. (stage de Hugo Deboise). Le but ultime est la modélisation de systèmes multi-composants et multi-échelles tels que celui représenté sur la
Figure A suivante. Grâce à une collaboration avec l'équipe de Michel Vivaudou à l'IBS (voir 2.4.2.2) nous avons commencé à utiliser le logiciel pour l'application de forces ayant pour but de reproduire les changements de conformations résultant de la fixation d'un ligand sur un récepteur membranaire Figure B suivante.



A - Modèle d'un système multi composants et multi-échelles comportant une molécule de fullerène inséré dans une membrane phospholipidique. On peut imaginer que la molécule de fullerène hydrophobe contient dans sa cavité une drogue qu'elle vectorise à travers la membrane.
B - Une application en cours du programme SAMSON au contrôle d'une force sur le domaine de liaison entre un récepteur membranaire et le canal ionique Kir6.2 (voir 2.4.2.2) et mimant les changements de conformation suite à l'interaction du ligand avec son récepteur. [8]
3.2 Modélisation « gros grain »
Des simulations de protéines dans un milieu aqueux explicite d'une durée d'une centaine de nanosecondes sont actuellement possibles. Cependant, la dynamique et la plupart des interactions pertinentes au sein des cellules (amarrage protéine-protéine, réarrangement suite à la fixation d'un ligand ou après une réaction biochimique, repliement) se produisent sur des échelles de temps pouvant dépasser la milliseconde, et impliquent de grands agrégats macromoléculaires. La simulation de tels systèmes n'est actuellement pas réalisable avec des modèles tout-atome. De plus, dans certains cas, les simulations au niveau atomique peuvent ne pas être les mieux appropriées pour une validation expérimentale car un nombre croissant d'agrégats biomoléculaires sont étudiés en utilisant des techniques de faible à moyenne résolution (tels que la cryo-microscopie électronique et la diffusion aux petits angles des rayons X). Ainsi, l'idée d'utiliser des descriptions simplifiées grâce à « l'intégration » d'un grand nombre de degrés de liberté dans un modèle de « grain » plus grossier que le niveau atomique parait naturelle. Cependant, la paramétrisation de ces grains peut s'avérer ardue, aussi, avons-nous choisi d'utiliser des modèles connus et validés (MARTINI) dans nos simulations dont un exemple est montré sur la figure ci-dessous.



A - Modèle de l'ATPase calcium (voir 2.4) insérée dans une bicouche phospholipidique en modèle tout atomes.
B - Représentation « gros grain » du même système. Chaque acide aminé est simplifié en 2 ou 3 sphères, les têtes polaires des phospholipides en 5 et les queues hydrophobes en 6 sphères. Les sphères interagissent entre elles vis un potentiel de type Martini modifié pour les protéines.
C - Modèle gros-grain de l'ATPase seule dans Sansom.
3.3 Logiciel de visualisation MPV3D
Serge Crouzy, Silouane Gérin (JD Lafontaine, MK Sautriau, M Ortega, JF Legout, J Flocard)
Le développement de ce logiciel n'avait pas pour but de concurrencer les très bons programmes VMD, PYMOL… mais plutôt d'insister sur des fonctionnalités absentes ou complexes dans ces logiciels et pourtant très utiles lors des phases initiales d'une modélisation. Par exemple :
- Outil de sélection rapide
- Grande souplesse dans la gestion de l'affichage d'un grand nombre de molécules (pdb)
- Superposition de structures
- Affichage clair et rapide des labels sur les atomes et résidus
- Interfaçage au programme CHARMM

Divers étudiants stagiaires se sont succédé pour contribuer à ce programme : (JD Lafontaine, MK Sautriau, M Ortega, JF Legout, J Flocard…)

Nous poursuivons
le développement du logiciel. Le système de sélection et de superposition de structures a été amélioré ; nous pouvons maintenant superposer des parties de molécules différentes. Le module de visualisation de trajectoires de dynamique moléculaire a été amélioré. Nous avons ajouté une fonction de lecture de fichiers de structures RMN et un module d'analyse de ces fichiers. Le programme a été porté sous QT4 pour systèmes Linux (Figure ci-dessous)



Présentation de la fenêtre principale et de la fenêtre de sélection du programme MPV3D. L'image montre une simulation d'un récepteur aux protéines G inséré dans une membrane phospholipidique de DPPC en modèle tout atomes incluant solvant et contrions.
3.4 Développement d'utilitaires en libre accès
Serge Crouzy
Nous avons développé toute une série d'outils d'analyse et de visualisation, la plupart en relation avec le programme de dynamique moléculaire CHARMM. Ces programmes sont disponibles pour les académiques par simple demande auprès de Serge Crouzy et citation des articles correspondants à ces travaux.

Programmes en C :
- Multibox : permet de créer des boites d'eau (pdb ou crd) de différente forme

- IR2D : Calcul de deux spectres bidimensionnels à partir d'un ensemble de spectres 1D enregistrés au cours de la cinétique de repliement d'une protéine, par exemple, par double transformée de Fourier. Un des deux spectres permet la mise en évidence de changements de structures corrélés pendant la réaction, l'autre spectre permet la détection de changements asynchrones (Noda I. Appl. Spectroscopy, 1998, 47: 1329-1336). Ce type d'analyse a été appliqué au laboratoire tant en spectroscopie FTIR qu'en RMN. (
collaboration avec Vincent Forge de l'équipe AFFOND)

Scripts shell :
- Stride2gnu.sh, stride2gnu.com et stride.gnu : permet de créer un graphique de l'évolution des structures secondaires d'une protéine à partir d'une série de PDBs

Scripts input pour CHARMM :
- Addions.inp : adds counterions to a protein structure by placing the mat the minimum of the electrostatic potential calculated on a grid around the protein
- Membrane suite : suite de scripts pour la création d'une bicouche phospholipidique hydratée et l'équilibration d'une protéine membrnaire à l'intérieur d'une bicouche ; à partir d'idées et de scripts développés par T Woolf et Benoît Roux

Amrp : automatic map refinement protocol : script faisant appel à CHARMM pour le calcul d'un profil d'énergie adiabatique le long d'une coordonnée de réaction

Programmes en Fortran :
-Wham : programme de débiaisage de profils d'énergie libre obtenus avec la commande PERT de CHARMM (à partir de listes de valeurs d'énergie) ou à partir de
fichiers de séries temporelles listant l'évolution d'1 ou 2 coordonnées de réaction contraintes par la technique de l' « umbrella sampling » (basé sur des idées de Benoît Roux).

Programme en C++
- Mpv3d : programme de visualition de protéines interfacé à CHARMM (voir 3.3) - En développement

Bien sûr, ces programmes sont donnés sans aucune garantie et tout retour de bug pour correction sera le bienvenu !

4 Méthodes
4.1 Prédiction de structures

Nous utilisons essentiellement le programme MODELLER pour effectuer des prédictions par homologie de structures de protéines.

4.2 Mécanique et Dynamique Moléculaire (MM/DM)
4.3 Calculs d'énergie libre : exemple de l'insertion du chlorure de tosyl dans la cyclodextrine
Serge Crouzy. (Collaboration avec Jacques Defaye et Law Ho, Faculté de pharmacie, UJF)

Nous avons mis au point en collaboration avec Benoît Roux de l'Université de Chicago un algorithme rapide basé sur la méthode « WHAM » pour combiner les résultats de simulation de DM par la méthode des perturbations et construire des profils d'énergie libre.

Les cyclodextrines sont des molécules cycliques comportant de 6 à 8 glucoses liés les uns aux autres par des liaisons covalentes de type ?14. Elles constituent des cavités hydrophobes dans lesquelles de petites molécules "hôtes" peuvent s'insérer par leur côté apolaire. Grâce à leur structure très particulière, les cyclodextrines sont utilisées dans des domaines très variés allant d'intermédiaires de réactions à la capture de métaux lourds (décontamination) ou au transport de drogues. Les réactions de complexation dans la cyclodextrine servent également de modèles pour comprendre les phénomènes d'inclusion en général ainsi que les interactions enzyme substrat.
Nous nous sommes intéressés en particulier à des complexes d'inclusion du chlorure de tosyl dans les &Mac178;-cyclodextrines (
Figure ci-dessous), première étape en vue d'une mono-fonctionnalisation sélective (c'est à dire de la synthèse de molécules actives greffées sur un groupement hydroxyle et un seul de la cyclodextrine). Cette synthèse a été réalisée par une équipe de la faculté de pharmacie de Grenoble avec laquelle nous avons collaboré.



A gauche : Description schématique des deux modes d'insertion du chlorure de tosyl dans la cabité de la cyclodextrine : A par le côté alccols primaires, B par le côté alcools secondaires.
A droite : Vue du modèle utilisé dans la simulation du chemin réactionnel en présence de solvant. Le TsCl est représenté en sphères de van der Waals.


Nous avons alors calculé les chemins d'énergie adiabatique et d'énergie libre (FEP) pour l'insertion du Tosyl dans la cyclodextrine par les 2 faces possibles de cette dernière et observé le bon accord entre constante de lision calculée et mesurée par RMN (
Figure suivante).



A. Représentation schématique d'une cyclodextrine montrant la coordonnée de réaction choisie à savoir la coordonnée de l'atome S du TsCl le long de l'axe de la cyclodextrine.
B. Profil d'énergie adiabatique de l'insertion du TsCl dans la cyclodextrine le long de la coordonnée Sz, dans le vide.
C. Le même dans le solvant (eau, modèle TIP3P
).

4.4 Chimie quantique, Mécanique Quantique (QM)
4.5 Méthodes mixtes Mécanique Moléculaire / Mécanique Quantique (QM/MM) : Application à la réactivité des métalloprotéines.
Yohann Moreau

L'étude de la structure, des propriétés et de la réactivité des molécules d'intérêt biologique, telles que les enzymes, les métallo-enzymes et les systèmes chimiques qui en sont inspirés, est abordée de façon théorique en faisant appel aux outils de la chimie quantique.

La résolution des équations de la mécanique quantique pour un système moléculaire permet d'accéder à des informations sur sa structure électronique ainsi que d'étudier l'évolution de cette dernière au cours d'une réaction chimique. Il est donc possible, grâce à ces outils, de modéliser la structure et la réactivité chimique des espèces étudiées.
Nous utilisons donc principalement des approches basées sur les méthodes usuelles de la chimie quantique (approche Hartree-Fock et dérivées) ainsi que de la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) afin de déterminer les propriétés des systèmes d'intérêt.

L'utilisation de ces méthodes dites ab-initio ne sont encore réservées qu'à la simulation de modèles limités à quelques centaines d'atomes à cause de leur coût en ressources de calculs. Les systèmes que nous nous proposons d'étudier, comme les métallo-enzymes, comportent couramment jusqu'à plusieurs milliers d'atomes.
Afin d'étudier les propriétés et la réactivité de telles espèces, nous mettons en œuvre une stratégie tirant parti du principe qu'une réaction chimique reste un phénomène local. Cette approche consiste donc à modéliser le système complet, y compris le solvant l'entourant, en décrivant la partie réactive ou d'intérêt particulier à l'aide d'une méthode quantique tandis que l'environnement l'est à l'aide de la mécanique moléculaire, beaucoup moins coûteuse en terme de temps de calcul.



Partition entre sous-parties QM et MM dans un modèle de la métallochaperone à cuivre Atx1. La partie QM correspond au site actif contenant le cuivre (boule orange) et est représenté en boules et bâtons.

Cette approche est désignée par son acronyme anglais QM/MM pour Quantum Mechanics / Molecular Mechanics (
Figure ci-dessus). L'avantage de cette approche est qu'elle permet de décrire la structure à l'échelle électronique de la partie réactive du système étudié tout en prenant en compte les effets de son environnement tels que ceux dus au solvant et au reste de la molécule. Nous pouvons ainsi envisager la détermination de chemins réactionnels pour des systèmes d'intérêt biologique mais aussi d'obtenir des informations sur leurs propriétés physico-chimique, recoupant et complétant ainsi les données expérimentales (par exemple spectroscopiques) qu'obtiennent les équipes du laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux sur les systèmes étudiés.

D'un point de vue pratique, nous avons choisi de travailler avec la méthode LSCF/MM, développée à l'Université de Nancy, qui est implantée dans une version modifiée du logiciel Gaussian03. Cela permet, en particulier, de bénéficier de la plupart des fonctionnalités de ce logiciel.